Efeito da suplementação de leucina sobre a proliferação de pré-osteoblastos da linhagem MC3T3-E1

Abstract

Introdução: a leucina (Leu) é um aminoácido (AA) essencial, de cadeia ramificada, presente na alimentação humana, principalmente no leite e seus derivados, que tem sido investigado por exercer um importante papel na sinalização celular. Contudo, a maioria dos estudos que avalia as respostas celulares mediadas pela Leu, trabalha dentro de uma perspectiva de normalidade na oferta do AA e pouco se sabe sobre os efeitos que a suplementação pode gerar sobre os mecanismos de proliferação celular. Os efeitos do excesso deste aminoácido, têm sido extensivamente estudado em diversos tipos de células, entretanto existe uma limitação importante na quantidade de informações disponíveis na literatura científica em relação as suas ações em células do tecido ósseo. Objetivo: este estudo teve como objetivo analisar os efeitos da suplementação de leucina sobre a proliferação de pré-osteoblastos da linhagem MC3T3-E1. Métodos: a cultura dos pré-osteoblastos da linhagem MC3T3-E1, foi realizada com α-MEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico. Após determinação de concentrações, o tratamento foi feito com a adição de Leu, diluída ao meio de cultura nas concentrações de 50 μM, o que corresponde a um acréscimo percentual de 12. 5% a mais do aminoácido ao meio de cultura, por 48 horas. A viabilidade e a proliferação celular foram avaliadas pela técnica do Trypan Blue. Para a identificação dos mecanismos relacionados a inibição da proliferação celular, foram realizados ensaios que avaliaram a citotoxicidade (LDH); apoptose (Anexina V); estresse oxidativo (TBARS e DCFH); perfil inflamatório (TGF-β 1 e CBA); autofagia (laranja de acridina e citometria de fluxo); senescência (DAPI) e dano ao DNA (teste cometa).Resultados e conclusões: a suplementação de Leu (50 μM) inibe a proliferação celular em 40%, com causas não relacionadas a necrose celular, apoptose, estresse oxidativo, inflamação ou autofagia. A suplementação de Leu provocou dano ao DNA, com consequente senescência e diminuição da proliferação celular de pré-osteoblastos da linhagem MC3T3-E1.

Introduction: leucine (Leu) is an essential branched-chain amino acid, present in dairy products, which has been investigated for exert an important role in cell signaling. However, most studies evaluating cellular responses mediated by Leu, works within a normal perspective in AA supply and little is known about the effects that supplementation can generate on the cell proliferation mechanisms. The effects of excess of this amino acid, have been extensively studied in many cell types, but there is an important limitation on the amount of information available in the scientific literature regarding their actions in bone cells. Objective: the aim of this study to determine the effects of leucine supplementation on proliferation of pre-osteoblasts of the MC3T3-E1 lineage. Methods: the MC3T3-E1 cells were kept in α-MEM supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% antibiotic. After initial determination of concentrations, the cells were treated during 48 hours, by the addition of 50 μM Leu, which corresponds to 12,5% in addition of the amino acid to the culture medium. Untreated cells represented the control group. The evaluation of the viability and proliferation of cultured cells was performed with Trypan Blue dye (0. 4%). To identify the mechanisms related to decreased cellular proliferation, assays were performed to verify cytotoxicity (LDH); apotosis (Annexin V); oxidative stress (TBARS and DCFH); inflammation (TGF-β 1 and CBA); autophagy (acridine orange and flow cytometry); senescence (DAPI and flow cytometry); and DNA damage (alkaline comet assay). Results and conclusions: Leu supplementation (50 μM) decreases cell proliferation by 40% with causes not related to cell necrosis, apoptosis, oxidative stress, inflammation or autophagy. The Leu supplementation caused DNA damage, with consequent increase in senescence and decrease of proliferation of MC3T3-E1 cells.