| Resumen: | Mitochondrial genomes (mitogenomes) are usually obtained through DNA sequencing produced by a set of conserved PCR primers that are designed to generate overlapping segments, thus completing the whole mitochondrial DNA. This may be a good strategy for some organisms. However, the translocation of cytoplasmic mitochondrial DNA (cymtDNA) into the nuclear genome (numt) is known to be a frequent phenomenon in many taxa, including the felid genus Panthera. Some strategies have been developed to avoid the unwanted amplification of numt, such as mitochondrial isolation followed by PCR or long-PCR. Recently, next-generation sequencing (NGS) approaches have begun to be extensively used in this field. Among these, RNA sequencing (RNAseq) seems to be extremely useful to generate mitogenomes and to avoid numts, as it allows the efficient capture at high coverage of mtDNA transcripts, avoiding pseudogenized nuclear copies. When we initiated this study, mitochondrial genomes of all species of the Panthera genus except the jaguar (P. onca) were available in public databases such as GenBank. Given the importance of this molecular marker for jaguar population studies and for phylogenetic analyses within the Panthera genus, the goals of this project were to (i) characterize the Panthera onca mitogenome, eliminating the possibility of erroneous amplification of numt; and (ii) to conduct the first mitogenomic analysis of the Panthera genus. We have characterized the mitochondrial genome of the jaguar employing RNA-seq data. The transcripts covered about 95% of the mitogenome, with the remaining gaps being complemented by PCR-based DNA sequencing, using specific primers designed for this purpose. All mitogenomic phylogenetic analyses (Maximum Likelihood, Maximum Parsimony, Neighbor-Joining and Bayesian Inference) supported a congruent topology (((N. nebulosa ((P. tigris (P. onca (P. uncia, (P. leo, P. pardus))))). This topology is unprecedented for the genus, but our results indicate that it correctly reflects the evolutionary history of mitochondrial DNA in this group. This study demonstrated that, with RNA-seq approach, almost the entire mitochondrial genome from an individual can be quickly characterized. Furthermore, this approach holds great promise especially in the case of groups plagued by the presence of large and recent numts, as is the case of Panthera species.
Genomas mitocondriais (mitogenomas) geralmente são obtidos através do sequenciamento de DNA realizado com uma série de primers conservados desenhados de maneira a se sobreporem, completando assim todo o DNA mitocondrial. Esta estratégia é bastante eficaz para alguns organismos. Entretanto, a translocação de segmentos do DNA mitocondrial citoplasmático (cymtDNA) para o genoma nuclear (numt) é um fenômeno conhecido para muitos táxons, incluindo os felinos pertencentes ao gênero Panthera. Algumas estratégias foram desenvolvidas para evitar a amplificação indesejada do numt, como por exemplo o isolamento de DNA mitocondrial seguido de PCR ou de PCR longo. Recentemente, as técnicas de sequenciamento de alto desempenho vêm sendo amplamente utilizadas. Dentre estas, o sequenciamento de RNA (RNA-seq) parece ser extremamente útil para gerar mitogenomas e evitar numts, uma vez que captura com alta cobertura apenas DNA mitocondrial transcrito, evitando as cópias nucleares pseudogenizadas. Quando este estudo foi iniciado, genomas mitocondriais de todas as espécies do gênero Panthera exceto P. onca estavam disponíveis em bases de dados como o GenBank. Tendo em vista a importância deste marcador molecular para estudos populacionais de onça-pintada (Panthera onca) e para estudos filogenéticos entre as espécies do gênero Panthera, os objetivos deste trabalho foram (i) caracterizar o mitogenoma de Panthera onca de forma a eliminar a possibilidade de amplificação errônea de numt e (ii) realizar a primeira análise mitogenômica do gênero Panthera. O genoma mitocondrial da onça-pintada foi caracterizado utilizando dados de RNA-seq. Os transcritos cobriram cerca de 95% do mitogenoma, sendo os demais segmentos cobertos por sequenciamento de DNA baseado em PCR, através da utilização de primers específicos desenhados para esta finalidade. Todos os quatro tipos principais de análises filogenéticas do mitogenoma (Maximum Likelihood, Máxima Parcimônia, Neighbor- Joining e Inferência Bayesiana) suportaram uma topologia congruente (((N. nebulosa ((P. tigris (P. onca (P. uncia, (P. leo, P. pardus))))). Esta topologia é inédita para o gênero, porém os resultados indicam ser esta a verdadeira história evolutiva do DNA mitocondrial dentro deste grupo. Neste trabalho, demonstrou-se que através de RNA-seq é possível obter-se praticamente todo o genoma mitocondrial de um indivíduo. Além disso, esta abordagem parece ser bastante promissora especialmente em casos onde grandes e recentes numts ocorrem, como é o caso das espécies pertencentes ao gênero Panthera. |
