| Resumen: | A tuberculose prevalece como uma das principais causas de morte no mundo ocasionadas por um único agente infeccioso, o Mycobacterium tuberculosis. A enzima Chiquimato Quinase (MtSK) codificada pelo gene aroK de M. tuberculosis, quinta enzima da via do chiquimato. catalisa a transferência de um grupo fosfato do ATP para o carbono 3 do grupo hidroxila do chiquimato, formando chiquimato-3-fosfato e ADP. A interrupção do gene aroK demonstrou que a enzima MfSK é essencial para a viabilidade do M. tuberculosis. Neste trabalho, apresentamos a purificação da enzima MtSK até a homogeneidade, análise por espectrometria de massa, sequenciamento de aminoácidos da porção N-Terminal, determinação do estado oligomérico da enzima em solução, cinética em estado estacionário, espectroscopia de fluorescência e calorimetria de titulação isotérmica. Os resultados encontrados sugerem que a reação catalisada pela enzima monomérica MtSK segue um mecanismo em equilíbrio-rápido aleatório para a adição dos substratos e uma liberação ordenada dos produtos, onde a liberação do chiquimato-3-fosfato é seguida pela liberação do ADP, resultando na enzima na sua forma livre. Os resultados de calorimetria demonstraram uma grande diferença de calor gerada na associação da enzima livre aos seus ligantes, revelando assinaturas termodinãmicas de interações não-covalentes para cada processo de ligação. Estes resultados ajudaram a compreender melhor o modo de ação da enzima MtSK e podem subsequentemente serem úteis para guiar o desenho racional de inibidores relacionados a esta enzima e que possam ser avaliados posteriormente como drogas anti-TB.
Tuberculosis (TB) still remains as one of main cause of mortality worldwide due to a single infectious agent, Mycobacterium tuberculosis. The aroK-encoded M. tuberculosis Shikimate Kinase (MtSK), the fifth enzyme of the shikimate pathway, catalyzes phosphate transfer from ATP to the carbon-3 hydroxyl group of shikimate, yielding shikimate 3-phosphate and ADP. Disruption of aroK gene has demonstrated that MtSK is essential for the viability of M. tuberculosis. Here we present purification of MtSK to homogeneity, mass spectrometry analysis, N-terminal amino acid sequencing, and oligomeric state determination of the recombinant protein. Steadystate kinetics, and studies on ligand binding by fluorescence spectroscopy and isothermal titration calorimetry (ITC) suggest that the chemical reaction catalyzed by monomeric MtSK follows a rapid-equilibrium random order of substrate binding, and ordered product release in which shikimate-3-phosphate release is followed by ADP dissociation to yield free enzyme. ITC results showed significant heat changes upon ligand binding to free MtSK enzyme, thereby providing thermodynamic signatures of non-covalent interactions to each binding process. These results provide a better understanding of the mode of action of MtSK that should be useful to guide the rational design of inhibitors of this enzyme that can be further be evaluated as antiTB drugs. |
