Uridina monofosfato quinase (EC 2.7.4.22) de Mycobacterium tuberculosis como alvo para desenvolvimento de drogas

Abstract

A Tuberculose (TB), causada pelo Mycobacterium tuberculosis, permanece entre as principais causas de morte por doenças infecto-contagiosas no mundo e estima-se que um terço da população mundial esteja infectada. A co-infecção com o HIV e a emergência de TB resistente a múltiplas drogas representam um desafio a saúde pública e tem estimulado a pesquisa por novos e mais efetivos agentes terapêuticos contra a doença. Os nucleotídeos pirimidínicos são moléculas essenciais em inúmeras reações bioquímicas e suas rotas de biossíntese são indispensáveis a progressão da TB. Nesse contexto, a proteína UMP quinase de M. tuberculosis (MtUMPK), que catalisa a fosforilação de UMP a UDP, é um alvo promissor para o desenho racional de drogas anti-TB. Neste trabalho é reportado a clonagem da região codificante do gene pyrH, a expressão da proteína recombinante em E. coli e a purificação da enzima. Além disso, confirmaram-se a identidade e a atividade biológica da MtUMPK. Cromatografia de exclusão por tamanho indicou que a proteína é um tetrâmero em solução e estudos cinéticos revelam um comportamento alostérico, sugerindo que a MtUMPK participa na regulação de síntese de purinas versus pirimidinas. Experimentos através da técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) revelaram que o mecanismo cinético para os substratos é sequencial ordenado, onde a molécula de ATP liga-se na enzima livre, seguido da ligação do UMP, e que a liberação dos produtos ADP e UDP ocorre de forma aleatória.

Tuberculosis (TB) remains a leading infectious killer worldwide and its causative agent, Mycobacterium tuberculosis, infects one third of the world population. The HIV co-infection and the emergence of multidrug and extensivelyresistant TB have provided a very alarming challenge to global health and led us to focus on the research for new and more effective therapeutics against the disease. Pyrimidine nucleotides are essential for many biochemical reactions and its synthesis constitutes an important step in the progression of TB. Therefore, the protein UMP kinase from M. tuberculosis (MtUMPK), which catalyses the phosphorylation of UMP to UDP and does not resemble its eukaryotic counterparts, is a promising target for the rational antitubercular drug design. In the present work, we report cloning of the pyrH gene coding region, heterologous recombinant protein in E. coli and purification to homogeneity. Moreover, we confirmed MtUMPK identity and its biological activity. Size exclusion chromatography showed that the protein is a tetramer in solution and kinetic studies revealed an allosteric behavior, suggesting that MtUMPK participates in the regulation of purine versus pyrimidine biosynthesis. Isothermal titration calorimetry (ITC) experiments showed that catalysis proceeds by a sequential ordered mechanism, in which the UMP substrate binds to the enzyme after the addition of ATP molecule, followed by a random displacement of ADP and UDP products.