| Resumo: | A engenharia de tecidos é um campo em crescimento para a regeneração de defeitos ósseos, com potencial para superar as limitações das técnicas de enxertia óssea existente atualmente. As células estromais mesenquimais têm demonstrado grande potencial de uso neste campo devido a sua multipotência. Essas células secretam uma gama de citocinas e fatores de crescimento estimulando células vizinhas no crescimento e reparo dos tecidos. Diversos tipos de matrizes para sustentação das células estromais mesenquimais têm sido desenvolvidos, tendo o uso do ácido hialurônico apresentado resultados promissores. Desta forma, a presente pesquisa tem por objetivo avaliar in vitro a influência da matriz de ácido hialurônico de baixo peso molecular (AH-BP) e de alto e baixo peso molecular (AH-ABP) combinados no mecanismo parácrino das células estromais mesenquimais derivadas do tecido adiposo, diferenciadas ou não em osteoblastos. As células estromais foram isoladas do tecido adiposo de ratos Lewis, expandidas e caracterizadas. Foi realizado o ensaio de citotoxicidade, através do teste MTT para avaliar a viabilidade celular na presença dos ácidos hialurônicos. Para avaliação da dosagem de fatores de crescimento foi realizado o ensaio ELISA. As células na 4ª passagem foram semeadas em placas de 6 poços, em triplicata, cultivadas por 30 dias em estufa umidificada a 37ºC e 5% de CO2 na atmosfera, e divididas em 6 grupos: (G1) ASC; (G2) ASC + AH-ABP; (G3) ASC + AH-BP; (G4) OSTEO; (G5) OSTEO + AH-ABP; (G6) OSTEO+ AH-BP. As ASCs foram cultivadas em meio completo por 27 dias, nos grupos 2 e 3 foi acrescido o AH respectivo e mantidas por mais 3 dias. As células OSTEO foram cultivadas em meio de diferenciação osteogênico por 27 dias, nos grupos 5 e 6 foi acrescido o AH e mantidas por mais 3 dias. Os resultados obtidos demonstraram que os maiores valores de secreção de fatores de crescimento ocorreram no grupo das ASCs em meio completo e, destas, quando acrescentado o AH-ABP. Após 27 dias em meio osteogênico, as células diferenciadas em osteoblastos apresentaram valores baixos de secreção dos fatores de crescimento. O uso de AH-BP teve baixa expressão, em relação a osteoindução dos fatores, quando comparado com o uso de AH-ABP. De acordo com os resultados, as células diferenciadas secretaram menos fatores do que as ASCs, com diferença estatística significativa. A expressão de VEGF, FGF e BMP-2 foram significativamente maiores nas ASCs e ASCs+AH-ABP. O fator de crescimento IGF-1 apresentou a sua maior expressão no grupo ASC+AH-BP, com diferença significativa dos demais grupos. Verificou-se que pareceu ser mais favorável o uso de células indiferenciadas em um futuro composto celular do que o uso dessas células já diferenciadas em osteoblastos. Períodos avançados de diferenciação pareceram levar a redução da osteoindução. A partir deste estudo observamos que a matriz de AH-ABP juntamente com ASCs tem potencial para influenciar positivamente no reparo do tecido ósseo através de uma maior secreção de fatores de crescimento osteogênicos, comparado com o uso da outra matriz de AH-BP.
Tissue engineering is a growing field for the regeneration of bone defects, with potential to overcome the limitations of bone grafting techniques currently available. Mesenchymal stromal cells have demonstrated great potential for use in this field because of their multipotency, these cells secrete a range of cytokines and growth factors stimulating neighboring cells in tissue growth and repair. Several types of matrices for the support of the mesenchymal stromal cells have been developed, and the use of hyaluronic acid presented promising results. The present research aimed to evaluate in vitro the influence of the matrix of low molecular weight hyaluronic acid (AH-BP) and high and low molecular weight (AH-ABP) combined in the paracrine mechanism of the mesenchymal stromal cells derived from adipose tissue, differentiated or not in osteoblasts. Stromal cells were isolated from the adipose tissue of Lewis rats, expanded and characterized. The cytotoxicity assay was performed through the MTT test to evaluate cell viability in the presence of hyaluronic acids. For the evaluation of the dosage of growth factors, an ELISA assay was performed. The cells in the 4th passage were seeded in 6-well plates, in triplicate, grown for 30 days in a humidified oven at 37 ° C and 5% CO2 in the atmosphere, and divided into 6 groups: (G1) ASC; (G2) ASC + AH-ABP; (G3) ASC + AHBP; (G4) OSTEO; (G5) OSTEO + AH-ABP; (G6) OSTEO + AH-BP. The ASCs were cultured in complete medium for 27 days, in groups 2 and 3 the respective AH was added end maintained for a further 3 days. OSTEO cells were cultured in osteogenic differentiation medium for 27 days, in groups 5 and 6 the HA was added and maintained for a further 3 days. The results showed that the highest values of growth factor secretion occurred in the group of ASCs in complete medium and of these, when AH-ABP was added. After 27 days in osteogenic medium, the cells differentiated into osteoblasts had low levels of secretion of growth factors. The use of AH-BP had low expression in relation to osteoinduction of the factors, when compared with the use of AH-ABP. According to the results, the differentiated cells secreted fewer factors than the ASCs, with significant statistical difference. Expression of VEGF, FGF and BMP-2 was significantly higher in ASCs and ASCs + AH-ABP. The IGF-1 growth factor presented the highest expression in the ASC + AH-BP group, with a significant difference in the other groups. It was found that the use of undifferentiated cells in a future cell compound appeared to be more favorable than the use of these already differentiated cells in osteoblasts. Advanced periods of differentiation seemed to lead to reduced osteoinduction. From this study we observed that the AH-ABP matrix together with ASCs has the potential to positively influence bone tissue repair through increased secretion of osteogenic growth factors, compared to the use of the other AH-BP matrix. |
