Desenvolvimento e implementação de um sistema para a detecção e quantificação absoluta de Mycobacterium tuberculosis usando o gene da proteína enoil redutase NADH-dependente (inhA)

Abstract

Tuberculosis is one of the main causes of death around of the world, a disease caused by the pathogen Mycobacterium tuberculosis. The severity of this global epidemic is exacerbated by the co-infection with the HIV, that drastically modified the epidemiology of the same one, causing an increase in the transmission dynamics, morbididy and mortality of infectaded subjects and the emergence of M. tuberculosis multidrug-resistant strains. In Brazil, practically one million of people is infected. With the advance of molecular biology and genetics, a diverse type of methods have been developed to allow fast diagnosis and a better understanding of the pathogenicity of infectious illnesses of several microorganisms. This study focuses on the implementation of a test to detect and quantify Micobacterium sp. using the polimerase chain reaction (PCR) associated with fluorescence. To this purpose, the gene of the enoil-ACP redutase NADHdependent (inhA) was selected as the identification gene and primers/probe marked with fluorophores (TaqMan®) were designed and synthesized. Standards for absolute quantification were produced through cloning of the inhA sequence in plasmids and further used as standards in assays for quantification of DNA samples isolated from sputum from patients diagnosed with tuberculosis. In parallel, M. tuberculosis cultures were used to assess the variability of the PCR assay compared with spectrophotometry, a standard method for cell number determination. The results showed that the system using inhA as identification gene in the implemented conditions was capable to amplify 106 the 101 cells of M. tuberculosis in culture. Compared to the method of the spectrophotometry, the real-time assay was more sensible, presenting less variation in absolute numbers. Samples DNA samples isolated from sputum of TB patients (n=13) classified as ++ and +++ according to the baciloscopy method showed a wide range of Mycobacterium numbers, that reached three orders of magnitude. Importantly, DNA samples isolated from sputum of otherwise healthy individuals did not show any increase in fluorescence, which attested the specificity and reliability of the test.

A tuberculose é uma das principais causas de morte ao redor do mundo envolvendo um único agente infeccioso, o Mycobacterium tuberculosis. A severidade desta epidemia global é exacerbada pela co-infecção com o HIV, que alterou drasticamente a epidemiologia da mesma, causando um aumento na dinâmica de transmissão, morbidade e mortalidade dos infectados, e com o surgimento de cepas multi-resistentes a drogas. No Brasil, praticamente um milhão de pessoas está infectado. Com o avanço da genética e biologia molecular, diversos tipos de métodos laboratoriais vêm sendo utilizados para o rápido diagnóstico e estudo da patogenicidade de doenças infecciosas de diversos microorganismos. A disponibilidade de seqüências genômicas de um grande número de microrganismos patogênicos proverá uma melhor compreensão de sua genética evolutiva, virulência e interações com o hospedeiro. O presente estudo tratou da implementacão de um teste para deteccão e quantificação absoluta de Micobacterium sp. a partir do emprego da reação em cadeia da polimerase associada a fluorescência. Para tanto, o gene da enoil-ACP redutase NADHdependente (inhA) foi selecionado como gene identificador e primers e sonda marcada com fluoróforo (TaqMan®) foram desenhados. Padrões para quantificação absoluta foram produzidos a partir da clonagem da sequencia identificadora em plasmídios, sendo posteriormente empregados em ensaios para quantificacão de amostras de DNA isoladas de escarro de pacientes portadores de tuberculose e células de M. tuberculosis em cultura. Os resultados mostraram que o sistema utilizando a inhA como gene identificador nas condições implementadas foi capaz de amplificar de 106 a 101 células de M. tuberculosis em cultura. Comparativamente ao método da espectrofotometria, o ensaio em tempo real empregando o gene da inhA foi mais sensível, apresentando menor variação em número absolutos. Amostras de DNA (n=13) isoladas de escarro de pacientes portadores de tuberculose de ++ e +++ foram submetidas ao ensaio e foram postivamente detectadas com variação de três ordens de magnitude. Amostras de indivíduos controle saudáveis não apresentaram sinal positivo, atestando a especificidade do sistema.